Document Type : Research Paper
Authors
1 MA in Archaeology, Islamic Azad University, Tehran Central Branch
2 Assistant Professor, Department of Archaeology, Islamic Art University, Esfahan
3 Associate Professor, Department of Medical Genetics, University of Tarbiat Modares
Abstract
According to zooarchaeological evidence, Central Zagros as a center of domestication experienced independently the first step of livestock domestications. It seems that Capra hircus have been domesticated about 10,500 B.C in Central Zagros and since then, has played a key role in the food economy of this region. Outstanding development of genetics shed new lights on the origins of goat and domestication process of this species in southwestern Asia. The aim of this study was a pure extraction of ancient DNA and then amplification of hypervariable segment of mtDNA through PCR technique. Then the prime query of this research was recognition of Neolithic goat haplotypes and their comparison with the modern standard haplotypes through phylogenetic tree.
Keywords
1- مقدمه
در چند دهۀ اخیر، شواهد باستانشناسی نشان داده است زاگرس مرکزی ایران یکی از ابتداییترین و مهم‌ترین مراکز اهلیسازی احشام بوده و در فرآیند نوسنگی شدن بخش شرقی هلال حاصلخیزی نقش مهمی ایفا کرده است. مطالعات باستانشناسی جانوری بر این گواه است که در میان نخستین سمسانان اهلی شده، گونۀ بز (کاپراهیرکس) (Capra hircus) در حدود 8500 تا 7000 ق.م در زاگرس ایران و قسمت‌هایی از آناتولی شرقی اهلی شده است Zeder and Hesse, 2000: 2254; Zeder 1999: 14)). در سال‌های اخیر علاوه بر شواهد باستانشناسی و جانور باستانشناسی، علم ژنتیک (مولکولی) نیز به عنوان ابزاری قدرتمند توانسته است خاستگاه بز و انتشار آن را در دنیای قدیم روشن کند و افق‌های جدیدی از مبحث اهلیسازی این گونه نمایان سازد (Zeder, et al. 2006: 295). یکی از مهم‌ترین بخش‌های مورد مطالعۀ باستان‌شناسان، ژنوم میتوکندری (mtDNA(Mitochondrial DNA)) است. ژنوم میتوکندری تنها از طریق مادر به ارث می‌رسد و به علت فقدان روش بازخوانی DNA ، مقدار جهش (Mutation) در آن ده برابر DNA هستهای است. این ویژگی‌ها به شناسایی و تشخیص منشأ یک نسل بسیار کمک کرده و ژنوم میتوکندری را به نشانگر مناسبی برای پژوهش‌های تکامل نژادی مبدّل کرده است (Zeder et al., 2006: 296; Brown et al., 1979: 68).
یکی از قسمت‌های مهم این ژنوم، منطقۀ فوق متغیّر1(HVS I) 1 است که در ناحیۀ D-loopقرار دارد و بخش غیر کدکنندۀ DNA میتوکندری (mtDNA) است. بسیاری از تحقیقات انجام شده در زمینۀ خاستگاه احشام (بهویژه بز) بر روی این قسمت از ژنوم میتوکندری تمرکز داشته‌اند (Zeder, et al., 2006: 295). از آغاز قرن 21 تاکنون، آنالیز منطقۀ فوق متغیّر1(HVS I) متعلق به نمونههای بز اهلی امروزی، به شناخت شش هاپلوگروپ اصلی بز در دنیای مدرن منجر شده است که از آنها به نام‌های A، B، C، D، F و G یاد میشود (Naderi, et al., 2008: 17659). در این تعریف باید اضافه کرد هر هاپلوگروپ مجموعهای از هاپلوتیپهایی است که یک جدّ مشترک دارند، اما هاپلوتیپها گونههای مختلف یک توالی هستند که مجموعهای منظم از نوکلئوتیدهای جایگزین در مناطق چندشکلی (Polymorphism) آنها را نمایان میکند.(Baca and Molak, 2008: 39)؛ از این رو هدف اصلی، ارزیابی و مقایسۀ هاپلوتیپهای ژنوم میتوکندری بزسانان نوسنگی و پیدایش خاستگاه ژنتیکی اهلیسازی آن در زاگرس مرکزی بوده است. هدف از این مطالعه استخراج دقیق DNA باستانی و سپس مقایسۀ فیلوژنی سکانس‌های فوق متغیر1 نوسنگی با نمونههای امروزی به منظور شناسایی هاپلوگروپ بزسانان نوسنگی است.
2- معرّفی محوطۀ چیاسبز
باتوجه به شواهد باستانشناسی، زاگرس مرکزی یکی از مناطق ابتدایی و مهم آغاز دورۀ نوسنگی و اهلیسازی در جنوب غرب آسیا بوده است. رود سیمره و نواحی پیرامون آن در زاگرس مرکزی با دارا بودن محوطههای فراپارینهسنگی و نوسنگی، جایگاه ونقشمهممنطقهرادر مطالعات باستانشناسی و اهلیسازی روشن میکند. یکی از مهم‌ترین محوطههای باستانی دورۀ نوسنگی بدون سفال، محوطۀ «چیاسبز شرقی» در درۀ سیمره است که به هزارۀ نهم و هشتم ق.م تعلق دارد. این محوطۀ نوسنگی در کنار رودخانۀ سیمره واقع در درۀ سیمره در استان لرستان قرار دارد. گاهنگاری نسبی و مطلق نشان می‌دهد در این ناحیه از اواسط هزارۀ نهم ق.م تا اواسط هزارۀ هشتم ق.م سکونت وجود داشته است (Darabi, et al. 2011: 260). این محوطه به خاطر موقعیت مکانی و زمانی خود، جزء مهم‌ترین محوطه‌هایی است که در پیدایش خاستگاه اهلیسازی بزسانان (بهویژه بز) نقش داشته است؛ چرا که ساختار توپوگرافی منطقه نشاندهندۀ یکی از غنی‌ترین مناطق بینکوهی برای تغذیۀ جانوران، بهویژه سمسانان است (نقشۀ 1). شواهد جانورباستانشناسی این ناحیه حاکی از وجود درصدفراوانیازبزسانان،بهویژهکاپراهیرکساست که به نظر می‌رسد این محوطه در مراحل ابتدایی اهلیسازی و یا مرحلۀ گذار از شکارورزی به اهلیسازی قرارداشته است. اگرچه نمونههای لایههای تحتانی هنوز به طور کامل تاریخگذاری نشده، گزارش اولیۀ حفاری در این ناحیه نمایانگر چهارده مرحلۀ استقرار نوسنگی بدون سفال است که نشان می‌دهد سکونت در این منطقه مستمر بوده و هیچ آثاری از فترت بین لایههای مختلف استقراری به دست نیامده است. نتایج آنالیز جانورباستانشناسی مجموعۀ استخوانی چیاسبز هنوز به طور کامل به چاپ نرسیده، اما مطالعات اولیه، این ناحیه را در میان ابتداییترین و مهم‌ترین مناطق اهلیسازی در زاگرس مرکزی و حتی قوس شرقی هلال حاصلخیزی قرار داده است (حصاری، 1389: 10).
3- موادّ و روش‌ها
3-1- بقایای استخوان جانوری: بیشتر مجموعه بقایای استخوانی محوطۀ چیاسبز به صورت پراکنده و خردشده به دست آمده است که این شکل غیرطبیعی می‌تواند حاکی از نوعی الگوی قصابی در این ناحیه باشد؛ به طوری که بعضی از بقایای استخوانی در حد شناسایی گونه و حتی عضو جانوری بودهاند(Darabi, et al. 2011: 258). برای آنالیز دقیق‌تر نمونههای ابتدایی بز در این محوطه و خاستگاه آن در زاگرس مرکزی، نمونهبرداری از لایههای تحتانی انجام شد تا تصویر روشن‌تری از اهلیسازی بز در این ناحیه داشته باشیم؛ چرا که به نظر می‌رسد بز در لایههای فوقانی با قدمت میانۀ هزارۀ هشتم به طور کامل اهلی شده و یا مراحل ابتدایی اهلیسازی را گذرانده باشد (حصاری، 1389: 11)؛ بنابراین، متخصصان آناتومی به منظور آزمایشهای ژنتیک از مجموعۀ استخوانی این محوطه، پنج نمونۀ سالم و قابل شناسایی از لایههای تحتانی انتخاب کردند.
3-2- استخراج DNA باستانی،PCR و سکانس: نمونهبرداری و استخراج DNA از بقایای باستانی چیاسبز طی مراحل خاصی انجام شده است ( 1139 :Cooper and Poinar, 2000) که به طور خلاصه به آن اشاره میشود: 1- برای اجتناب از DNA مدرن و آلودگی‌های احتمالی حین حفاری و جابهجایی، نمونه‌ها ابتدا با آبِ دو بار تقطیر شسته و سپس به مدت 5 دقیقه درون آب ژاول قرار داده شدند تا خاک، رسوبات و ناخالصی‌های آن جدا شود؛ 2- سطح بیرونی استخوان‌ها با استفاده از ابزار پزشکی تا میزان 5 میلیمتر برداشته شد و سپس به مدت 30 دقیقه در تمامی جهات در زیر اشعۀ UV قرار گرفتند؛ 3- نمونه‌ها با استفاده از یک هاون آزمایشگاهی استریل به پودر تبدیل شدند. استخراج DNA باستانی با یک کیت آزمایشگاهی2 انجام پذیرفت. برای تکثیر منطقۀ فوق متغیّر1 (HVS I)پرایمر زیر استفاده شد:
F (5-CGTGTATGCAAGTACATTAC-3)
و
R (5-CTGATTAGTCATTAGTCCATC-3)
شرایط آزمایشی PCR بعد از چند مرحلة آزمون و خطا طبق جدول 1 تنظیم شد.
جدول 1
|
نام مرحله |
نام لاتین |
دمای مورد نظر |
مدت زمان |
|
1- واسرشته سازی اولیه |
Initial Denaturation |
95 درجه سانتیگراد |
5 دقیقه |
|
2- واسرشته سازی |
Denaturation |
95 درجه سانتیگراد |
50 ثانیه |
|
3- اتصال آغازگر |
Annealing |
60 درجه سانتیگراد |
50 ثانیه |
|
4- بسط آغازگر (30سیکل مرحله2 تا 4) |
Extension |
72 درجه سانتیگراد |
50 ثانیه |
|
5- بسط نهایی آغازگر |
Final Extension |
72 درجه سانتیگراد |
10 دقیقه |
شرایط دمایی آزمایش PCR
حجم کلی PCR 30 میکرولیتر است که حجم DNA را نیز شامل میشود. آنچه در میزان DNA غیر عادی به نظر می‌رسد، مقدار 5 میکرولیتر DNA است؛ چرا که به علت قدمت زیاد نمونه‌ها، غلظت DNA استخراج شده کم بوده و برای دستیابی به نتایج مطلوب از DNA بیشتری استفاده شده است. حجم کلی PCR طبق مقادیر جدول 2 انجام گرفته است.
جدول 2
|
PCR buffer 1X |
|
Forward Primer 10pM |
|
Reverse Primer 10pM |
|
MgCl2 50mM |
|
dNTP 10mM |
|
Taq 1U/µl |
|
DNA 0/8 ng/µl |
|
H2O (Up to final volume 30 µl) |
غلظت مواد به کار رفته در آزمایش PCR
طول قطعات تکثیر شده 620 باز است، برای مشاهدۀ کارکرد تکنیک PCR، محصول PCRبه روی ژل پلی آکریلامید %12 برده شد و پس از مشاهدۀ تک باند اختصاصی (شکل 1)، نمونههای مذکور را شرکت ماکروژن3 با روش سانگر سکانس کرده است (شکل 2).
تمامی مراحل آمادهسازی پودر استخوان، استخراج و PCR با رعایت نکات ذیل انجام شده است:
1- استخراج DNA باستانی و آنالیز PCR در مکان‌های جدا و عاری از هرگونه DNA بز مدرن و باستانی صورت گرفته است؛
2- هیچ‌گونه آلودگی هنگام استخراج و PCR نمایان نشد؛ چرا که نمونة PCR شامل کنترل NTC بود تا آلودگی‌های احتمالی زیر نظر گرفته شود؛
3- در تمامی مراحل از ماسک صورت و دستکش استریل و پوشش کامل بدن برای اجتناب از آلودگی DNA مدرن استفاده شده است؛
4- تمامی ابزارآلات آزمایشگاهی بهکار گرفته شده در این تحقیق، مختص آزمایشهای نمونههای باستانی بوده است.
3-3- آنالیز سکانس (توالی): سکانس نمونههای باستانی چیاسبز با استفاده از نرمافزار سیکمن (Seqman II v5.00) آنالیز و ویرایش شده و با مقایسه با دیگر سکانس‌های فوق متغیر1 (HVS I) بز مدرن در مرکز ملی اطلاعات زیست- فنآوری )NCBI( درخت فیلوژنی با نرمافزار مگا (Mega 4 v4.00) رسم شده است (شکل 3).
4- رسم و توصیف درخت فیلوژنی
بررسی سکانس‌های نوسنگی چیاسبز و مقایسۀ آنها با نمونههای بانک ژن نشاندهندۀ حفظ DNA باستانی در شرایط اقلیمی درۀ سیمره است؛ چرا که در هر پنج نمونه قرابت بسیار زیاد سکانس‌ها (%98) از طریق بلاست4 (Blast) نمایان شد. درخت فیلوژنی این تحقیق با روش اتصال همسایگی (Neighbourjoining) با در نظر گرفتن شاخص Bootstrap 1000 با استفاده از نرمافزار مگا (Mega 4 v4.00) رسم شد. برای رسم درخت فیلوژنی علاوه بر سکانس‌های نوسنگی، از 22 سکانس مرجع استفاده شده است که متعلق به شش هاپلوگروپ اصلی و تعریفشدۀ بز امروزی هستند. این سکانس‌های مرجع در مطالعات قبلی مورد تأیید و آنالیز قرار گرفتهاند و مرجعی جهانی به حساب می‌آیند (Han, et al. 2010: 43, Naderi, et al. 2007: 8).
رسم درخت فیلوژنی با پنج سکانس نوسنگی چیاسبز و 22 سکانس مرجع، نشاندهندۀ شش هاپلوگروپ اصلی است که در آن نمونههای مدرن، درون شش خوشۀ اصلی درخت (هاپلوگروپ) و سکانس‌های نوسنگی با نام اختصاری(PPN 1-5) 5 درون هاپلوگروپ A قرار گرفتهاند (شکل 3). هاپلوگروپ A شامل پنج هاپلوتیپ نوسنگی و شش هاپلوتیپ بز مدرن است و دیگر خوشههای اصلی درخت به ترتیب، به هاپلوگروپهای D (3 هاپلوتیپ)، G (3 هاپلوتیپ)، B (4 هاپلوتیپ)، C (4 هاپلوتیپ)، F (2 هاپلوتیپ) تعلق دارند. میزان اعتبار خوشههای اصلی (هاپلوگروپها) درخت فیلوژنی را Bootstrap > 90% تأیید کرده است.
5- بحث و نتیجه
تحقیقات قبلی بر روی بخش فوق متغیر1 ژنوم میتوکندری بز مدرن، به شناسایی شش گروه متفاوت میتوکندری (هاپلوگروپ) منجر شد. نخستین هاپلوگروپهای شناسایی شده به نام‌های A، B و C بودهاند؛ به طوری که هاپلوگروپ A با بیشترین پراکنش جغرافیایی و جامعۀ آماری در دنیا، هاپلوگروپ B فقط در شبهقارۀ هند و چین و هاپلوگروپ C نیز با تعداد بسیارکم، تنها در کشورهای اسلوونی، سوئیس و مغولستان نمایان شدند .(Luikart, et al., 2001: 5929)
مطالعات جدیدتر باعث شد تا هاپلوگروپهای دیگری به نام‌های D، F و G یافت شوند؛ بدینترتیب که D به طور محدود در پاکستان، چین و هند یافت شد، مادامیکه F وG با تعداد کلّی بسیار کم در کشورهای پاکستان، هند، اسپانیا و ایتالیا وجود داشته است.(Han, et al. 2010: 42; Naderi, et al. 2007: 2; Sultana, et al. 2003: 420; Sardina, et al. 2006: 376; Joshi, et al. 2004: 456; Mannen, et al. 2001: 153)
در این مطالعه مقایسۀ هاپلوتیپهای نوسنگی چیاسبز با هاپلوتیپهای مدرن در درخت فیلوژنی، نشان می‌دهد که نمونههای نوسنگی درون هاپلوگروپ A قرار گرفتهاند. مطالعات ژنتیکی نشان داده است انتشار این هاپلوگروپ در دنیای قدیم تقریباً از زمان نخستین اهلیسازی بز در خاور نزدیک (حدود 10 هزار سال قبل) آغاز شده است (Luikart, et al., 2001: 5927). پیدایش هاپلوگروپ A در دورۀ نوسنگی زاگرس ایران را می‌توان به پیدایش خاستگاه این هاپلوگروپ در قسمت شرقی هلال حاصلخیزی نسبت داد؛ چرا که پیش‌تر بر اساس مطالعات جانورباستانشناسی نیز شواهد اولیة اهلیسازی بز در کوههای زاگرس ایران به دست آمده است .(Zeder, 2005: 143; Zeder and Hesse, 2000: 2254) علاوه بر هاپلوتیپهای چیاسبز، در مطالعۀ دیگری، دو سکانس بز باستانی از ناحیة تپه قبرستان در دشت قزوین (دورۀ مس و سنگ) متعلق به هاپلوگروپ A به دست آمده است Fernandez, et al. 2005: 53)). اگرچه دشت قزوین با فاصلۀ چند صد کیلومتری از زاگرس مرکزی و آناتولی قرار دارد که دارای ابتداییترین شواهد اهلیسازی و رمهداری بز هستند، پیدایش هاپلوگروپ A بز در این منطقۀ جغرافیایی حاکی از آن است که نسل A بز پس از طی فرآیند اهلیسازی ابتدایی در غرب ایران (بهویژه زاگرس مرکزی) درون فلات مرکزی ایران منتشر شده است (نقشۀ1). این فرآیند ناشی از این است که گروههای انسانی بز را جابهجا کردهاند؛ چرا که بز از ابتدای دورۀ نوسنگی تاکنون نقش بسیار مهمی در اقتصاد معیشتی آنها ایفا کرده است .(Porter, 1996: 124)
از سوی دیگر، مطالعات ژنتیکی اثبات کرده است بز وحشی کاپرا ایگگروس (Capra aegagrus) نزدیک‌ترین و قوی‌ترین نمایندة ژنتیکی، به عنوان اجداد بز اهلی امروزی است (Mannen, et al. 2001: 153). بررسی ژنوم میتوکندری نمونههای بز وحشی و اهلی مدرن نشان داده است که خاستگاه نسل A بز به احتمال زیاد در شرق ترکیه قراردارد (Naderi, et al. 2008: 17663). در این منطقه همچنین شواهد جانورباستانشناسی نیز نشان می‌دهد ابتداییترین اهلیسازی بز در مناطق نوالیچوری(Peters, et al. 2005: 120; Peters, et al. 1999: 40) و چایاونو رخ داده است .(Hongo and Medow, 2000: 130)
اگرچه هاپلوگروپ A در میان بزهای وحشی (به عنوان اجداد بز اهلی) مدرن فلات مرکزی و زاگرس ایران ناپدید شدهاند و تنها در شرقی‌ترین بخش ایران به چشم می‌آیند و بر اساس پیدایش نسل A در میان بزهای وحشی شرق ترکیه، خاستگاه اهلیسازی این هاپلوگروپ به این منطقه نسبت داده شده است(Naderi, et al. 2008: 17661)، بر اساس وجود هاپلوتیپهای نوسنگی چیاسبز در این تحقیق، این ایده بیان میشود که زاگرس مرکزی نیز به عنوان مرکز مستقل اهلیسازی، توانایی بالقوة اهلیسازی و انتشار هاپلوگروپ A را در فلات مرکزی ایران و دنیای قدیم داشته است؛ چرا که شواهد باستانشناسی نیز زاگرس ایران را با فاصلۀ بسیار طولانی از شرق ترکیه، به عنوان مرکز مستقل اهلیسازی معرفی کرده است (نقشۀ1).
درخت فیلوژنی این مطالعه نشان می‌دهد پیدایش هاپلوگروپ A در درۀ سیمره (زاگرس مرکزی) نشاندهندۀ اهلیسازی ابتدایی این نسل بز و انتشار آن از این خطۀ جغرافیایی است. بدینترتیب، با قطعیت و اطمینان بیشتری می‌توان از آغاز پراکنش نسل A بز در دنیای قدیم سخن گفت؛ چرا که پژوهشگران آغاز انتشار هاپلوگروپ بسیار گستردۀ A را همزمان با شروع اهلیسازی اولیه (حدود 10 هزار سال قبل) می‌دانند. پیدایش نسل A بز در محوطۀ نوسنگیِ بدون سفالِ چیاسبزِ شرقی بر نتایج تحقیقات قبل صحه می‌گذارد. امروزه بیش از %90 بزهای اهلی دنیا متعلق به هاپلوگروپ A هستند و این نسل دارای بیشترین پراکنش جغرافیایی در نقاط مختلف دنیاست. این پژوهش، نخستین بررسی ژنوم میتوکندری بزسانان زاگرس مرکزی است و تحقیقات مولکولی بیشتر بر روی بقایای استخوان جانوری مناطق نوسنگی در زاگرس مرکزی و جنوبی و همچنین نواحی مس و سنگ فلات مرکزی می‌تواند درک بهتر خاستگاه اهلیسازی احشام را سبب شود.
تشکّر و قدردانی
از آقای مهندس کاظم چاووشیپور، تکنیسین بخش آناتومی دانشکدۀ دامپزشکی دانشگاه تهران و نیز کارکنان گرامی آزمایشگاه ژنتیک پزشکی تهران به خاطر همکاری صمیمانه‌شان بسیار سپاسگزاریم.
پینوشت
1. Hypervariable Segment I
2. GeneClean kit for ancient DNA (MP Biomedicals, USA)
3. Macrogene Company, South Korea
4. Basic Local Alignment Search Tool
5. Pre-Pottery Neolithic
ضمائم
نقشۀ 1. پیدایش هاپلوگروپ A باستانی در زاگرس مرکزی و دشت قزوین. حضور هاپلوگروپ A بز وحشی امروزی (به عنوان اجداد بز اهلی) در آناتولی شرقی و شرق ایران
شکل 1. محصولات PCR به همراه سایز مارکر 50bp بر روی ژل آکریلامید.
(ستون Goat نمونۀ بز نوسنگی، ستون NTCبرای کنترل آلودگی و
ستون control نمونه بز امروزی به عنوان کنترل مثبت)
شکل 2. بخشی از تعیین توالی یکی از نمونههای نوسنگی
شکل 3. درخت فیلوژنی (تکامل نژادی)
)